本发明提供了基于多重PCR‑DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组和试剂盒及其应用，属于兽医临床检测技术领域。基于多重PCR‑DHPLC检测猪链球菌耐药基因的引物组，包括扩增ermA基因、ermB基因、mefA基因和msrD基因的引物对。本发明提供的引物组具有较强的特异性，能够用于PCR扩增和DHPLC分析。本发明引物组或试剂盒在猪链球菌耐药基因检测中的应用，针对猪链球菌耐大环内酯类药物的四对耐药基因检测，能够同时检测四段目标基因，符合快速高通量技术的需要，检测特异性良好、灵敏度高，可以用于临床检测猪链球菌ermA、ermB、mefA、msrD四种耐大环内酯类药物耐药基因的检测。