本发明提供了一种转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系的选育方法及其应用，属于作物新品种选育技术领域。利用转基因抗虫棉花核不育两用系中的不育株与转基因高衣分材料杂交，以转基因抗虫核不育两用系为轮回亲本与杂交后代中的高衣分可育植株连续回交六代，然后经两代自交、一代对株杂交和一代混合交，并结合回交、自交、对株交后代的抗虫性鉴定、育性鉴定以及目标基因的分子鉴定，选育出转基因抗虫高衣分棉花核不育两用系。本发明方法步骤合理、操作简单，缩短了育种周期。