本发明公开了一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法，涉及植物基因工程技术领域。本方法主要是：①在隐性亲和系油菜基因组中鉴定出2个SMI2的同源序列：分别命名为BnS6‑SMI2和BnS7‑SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；②根据BnS6‑SMI2基因的特异序列设计基于CRISSPR/Cas9的三个sgRNA，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。本发明证明BnS6‑SMI2调控自交不亲和性，并利用CRISPR/Cas9创造了不同突变类型的株系；其自交后代表现明显的自交不亲和表型，为甘蓝型油菜自交不亲和杂交育种提供了新的种质资源，同时在油菜分子设计育种中具有广阔的应用前景。