本发明公开了一种鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR检测引物及试剂盒。本发明提供了一组检测非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的特异性引物和探针，通过RT‑qPCR方法同时检测非洲猪瘟病毒野毒株B646L基因和缺失株的EGFP、mCherry基因，能够鉴别样本是非洲猪瘟病毒野毒株还是基因缺失株。该检测方法灵敏度高，特异性强，B646L、EGFP和mCherry基因阳性标准质粒最低检测浓度分别为5.94×10‑9ng/μL、9.67×10‑9ng/μL、5.85×10‑9ng/μL。该方法检测范围广泛，能检测出多种非洲猪瘟病毒基因缺失株，且检测过程快速，高效，适合进行大批量检测，为鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失毒株提供了新手段，可用于生产实践中对非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的快速鉴定。