本发明公开了一种三叶青试管苗离体保存的方法，属于植物的栽培技术领域，包括以下步骤：选取三叶青茎尖作为外植体，进行预培养后进行第二次培养；将第二次培养的茎尖用海藻酸钠包埋球；将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上,在无菌空气流中干燥1‑2h无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装10‑20个包埋球；将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架或沙袋后投入液氮进行超低温保存。本发明未形成愈伤组织，避免产生遗传变异，遗传稳定性好，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达99％以上。