本发明属于生物领域，公开了一种基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，包括如下步骤：步骤1：提取H9N2亚型禽流感病毒的RNA，并根据RNA获得病毒的cDNA；步骤2：以cDNA为模板采用8对引物扩增得到H9N2亚型禽流感病毒8个片段的PCR产物；步骤3：将PHW2000质粒进行酶切得到线性化片段；步骤4：将H9N2亚型禽流感病毒8个片段的PCR产物分别与线性化的PHW2000载体进行同源重组得到8种重组质粒；步骤5：将8种重组质粒共同转染293T及MDCK混合培养细胞，得到重组的H9N2病毒；其中，8对引物的序列分别为如序列表SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：17所示。该方法的优势在于：操作简单、重组精确、拯救效率高。