本发明涉及一种B族链球菌核酸检测试剂盒及其检测方法。本发明提供B族链球菌核酸检测引物探针组合，如SEQ ID No.1‑3、SEQ ID No.4‑6、SEQ ID No.7‑9、SEQ ID No.10‑12所示。在本发明所提供的B族链球菌核酸检测试剂盒中，优选dATP:dGTP:dCTP:dUTP为1：1：1：1；UNG酶:Taq酶为1：1。使用本发明所述试剂盒检测B族链球菌核酸时，特异性高，可检出B族链球菌的全部血清型；抗污染能力强，有效降低残留的扩增产物，避免产生假阳性结果；检测速度快、重复性好，可定性检测围产期孕妇生殖道分泌物和直肠分泌物样本的B族链球菌核酸。