本发明涉及一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，包括以下步骤：乳腺组织采集、前处理、乳腺组织块的消化、接种、细胞纯化、细胞消化传代及细胞冻存。该分离方法使用酶消化组织块法分离猪乳腺上皮细胞，建立生长稳定的猪乳腺上皮细胞系，分离细胞所需时间短，所获细胞纯度高，无需反复纯化，只需纯化1‑2次即可得到高纯度的细胞；对细胞损伤小，获得的细胞活性高；细胞生长稳定，培养至第10代，细胞增殖率无显著变化，便于长期试验研究，为猪乳腺组织生理代谢机制研究提供稳定的试验材料。