本发明属于生物pH和氧气浓度荧光检测的技术领域，具有为用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法。本发明荧光纳米传感器是聚苯乙烯纳米颗粒，其内部疏水，包埋有氧敏感探针，以及pH和氧气惰性的参比荧光探针，其表面修饰有氨基基团，并通过共价连接方式在纳米颗粒表面修饰pH敏感探针。该传感器采用一锅法聚合反应合成得到。该荧光纳米传感器具有生物相容性好、制备简单、灵敏度好、可逆性好的优点，在适当波长的激发光照射下，传感器暴露在不同pH和不同氧浓度环境中，其荧光强度会发生明显变化，可用于细胞内pH和氧气浓度的同时测量。比率型检测方法荧光检测的准确性更高，且细胞毒性极低。