本发明涉及煤矿突水水源判别技术领域，具体涉及一种基于微生物测试的煤矿突水水源判别方法，主要包括以下步骤：确定煤矿受威胁的含水层、对受威胁的含水层进行抽水检测、建立不同含水层水样细菌总数与四个因素的函数关系、煤矿发生突水时对出水水样进行检测、判断煤矿突水水源、采取公知的防治水措施保障煤矿矿井安全不受水害威胁；本发明通过建立不同含水层水样细菌总数与溶解氧量、出水流量、出水点的水温度和取样后到检测前的时间四个因素的函数关系，在煤矿发生突水时，对出水水样进行检测，从而快速判断出煤矿突水水源，操作简单、检测方便、检测准确度更高，同时不会破坏环境。