本发明提供了一种多层氧化石墨烯改性微生物载体的制备方法和应用。该方法利用硅烷偶联剂对聚氨酯载体进行表面功能改性，通过在载体表面接枝多层氧化石墨烯，增大载体的比表面积和表面结构，加快了微生物表面附着过程，从而提高载体的生物负载能力；并且，通过氧化石墨烯为聚氨酯载体引入亲水性功能基团，提高改性后的聚氨酯生物载体的亲水性，从而增强载体的生物亲和性。同时，本发明提供的多层氧化石墨烯改性微生物载体的制备方法具有工艺简单、成本低、改性载体的热稳定性强等特点，其制备的改性微生物载体将有利于解决生物固定化过程中挂膜时间长的问题，在生物反应污水处理系统中具有很好的应用前景。