本发明公开了一种利用固定化酶制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖的方法，包括原料预处理、活性炭固定化酶法制备具有抑菌活性的瓜皮果胶低聚糖及其分离纯化。具体步骤如下：瓜皮粉加入一定量活性炭固定化酶，水解得瓜皮果胶低聚糖粗品，通过层析柱进行分离纯化，得具有抑菌活性的果胶低聚糖；分离纯化最佳条件为：以大孔树脂为柱层析填料，经95%乙醇溶液淋洗得具有抑菌效果低聚糖组分。本发明采用固定化酶法制备的果胶低聚糖，对食品行业常见的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用。该制备过程条件温和且极易控制，所得低聚糖具有优异的功能活性，可作为防腐杀菌剂应用于保健品、食品、药品行业。