本发明公开了一种定量分析抗结核药血浆浓度的LC‑MS/MS方法，该方法通过S1标准工作液配制、S2样品制备、S3样品处理、S4样品检测及S5标准曲线制作和定量分析，可同时对异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇进行检测，样品前处理过程简单易操作，所用试剂均为常规试剂，成本较低。以反相150mm×2.1mm的C18柱、控制流速为0.3mL/min、柱温为30℃，可以很好地解决异烟肼、利福平、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇的极性差异大的问题，分离效果较好，且成本较低。本申请具有较高的灵敏度、准确度与精密度，检测线性范围宽，检测时间短，可作为一种可靠的宜推广的检测方法用于临床一线抗结核病药物的治疗浓度监测。