本发明公开了一种牛结核分枝杆菌抗体双孔快速检测卡及检测方法，包括安装在外壳内的PVC底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在PVC底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间设置检测线和质控线，外壳上对应检测线和质控线开设视窗孔，在视窗孔一侧、检测线和之间设有定量标识线，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。本发明通过加样孔加样品、清洗孔加稀释液的方式不但可提高被检测物的灵敏性、精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和简便特性。