本发明属于膜分离技术领域，具体涉及一种耐极性非质子有机溶剂聚酰亚胺分离膜及制备和应用。本发明制备方法包括以下步骤：(1)将二胺单体加入溶剂溶解后，加入二酸酐单体进行缩聚反应获得聚酰胺酸溶液；(2)将聚酰胺酸溶液通过静电纺丝制备聚酰胺酸纳米纤维；(3)将聚酰胺酸纳米纤维进行亚胺化，制备得到聚酰亚胺纳米纤维基膜；(4)在聚酰亚胺纳米纤维基膜的表面通过界面聚合的方法制备聚酰胺选择层，即可获得聚酰亚胺分离膜。本发明采用了一步简单的聚酰胺酸合成结合静电纺丝、热亚胺化和界面聚合的方法来制备聚酰亚胺分离膜，具有优异的耐极性非质子有机溶剂特性，和优异的分离选择性。