本发明属于微生物荧光染色技术领域，具体涉及一种生殖道分泌物多重荧光染色液及其制备方法和应用。所述的生殖道分泌物多重荧光染色液包括荧光素、核酸染料、抑菌剂、防淬灭剂、通透剂和缓冲液；pH4.5‑6.0。本发明的生殖道分泌物多重荧光染色液对阴道分泌物样本的染色时间短，适合临床大批量开展工作；染色结果稳定可靠，细胞和各种病原微生物的形态结构清晰，对比鲜明，在显微镜下可清晰的观察到各种病原微生物的形态、大小和分布，以及涂片中各种细胞的种类和数量。此外，本发明的多重荧光染色液稳定性好，可长期使用，大大降低染色成本。