本发明提供一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，包括以下步骤：准备用于分化的培养瓶或培养皿；准备iPSCs；D0接种细胞；D1‑D4分化；D5‑D6分化；CD144阳性细胞磁珠分选；瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞的培养与传代。本发明提供的将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，可稳定高效的获得大量均一的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞，可满足组织工程瓣膜应用于临床对种子细胞的要求，而且本发明方案同样可用于胚胎干细胞的分化，可用于心脏瓣膜疾病发病基质的研究。