本发明公开了一种特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗原结合蛋白、抗体或活性片段，包含所述抗原结合蛋白、抗体或活性片段的非洲猪瘟病毒p72蛋白的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒包被有单克隆抗体ASFV‑p72‑5G8的酶标板、阳性对照和阴性对照、HRP标记的检测抗体ASFV‑p72‑12F6、样品稀释液、显色液以及洗涤液。其中所述抗体ASFV‑p72‑5G8和ASFV‑p72‑12F6分别由杂交瘤细胞株ASFV‑p72‑5G8和ASFV‑p72‑12F6分泌。本发明的试剂盒以5G8为捕获抗体、以12F6偶联HRP为检测抗体建立了双抗体夹心ELISA方法，可特异性的检测ASFV，该双抗夹心ELISA方法操作简便，灵敏度高，特异性好，为ASFV感染的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。