本发明属于生物技术技术领域，具体公开了一种用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品的制备方法。该制备方法包括以下步骤：1)选择具有乙酰化修饰的蛋白质A以及乙酰化转移酶B；2)制备共转染质粒A和质粒B的蛋白样品以及单独转染质粒A的蛋白样品；3)选择一个共转染质粒A和质粒B的蛋白样品以及单独转染质粒A的蛋白样品一起完成免疫印迹分析；4)将其余的共转染质粒A和质粒B的蛋白样品跑SDS‑PAGE胶后，在考马斯亮蓝染液中孵育过夜后脱色，再将目的条带切下来放入离心管中，即得所述用于鉴定特异性蛋白质乙酰化修饰样品。本发明制备得到的蛋白样品能显著增强质谱鉴定出特异性蛋白质乙酰化修饰位点的成功率。