本发明涉及甲状腺结节良恶性相关标志物及其应用，所述标志物为以下目标标志物：TTC34基因或基因组的TTC34序列，SLC16A3基因或基因组的SLC16A3序列，RARG基因或基因组的RARG序列，以及选自RCOR2基因或基因组的RCOR2序列和ITPKA基因或基因组的ITPKA序列中的任意一种或全部两种。本发明涉及与所述目标标志物杂交的引物分子和/或探针分子在制备诊断甲状腺结节良恶性的检测试剂或诊断试剂盒中的应用，以及用于确定目标标志物的甲基化水平的装置在制备诊断甲状腺结节良恶性的诊断试剂盒中的应用。