一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性RT‑PCR试剂盒及其使用方法，属于生物技术领域。该试剂盒包括A液(RT‑PCR缓冲液、RT‑DNA聚合酶和灭菌双蒸水)、B液(引物对、探针)、阴性质控标准品和阳性质控标准品组成，其中包括用于检测布鲁氏菌的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及探针seq ID No.3，以及检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性的特异性引物对seq ID No.4和seq ID No.5以及探针seq ID No.6。该RT‑PCR试剂盒实用性强，耗时短，可重复性好，通过RT‑PCR扩增后，能够快速、有效、直观的鉴别临床样品中是否含有阿米卡星耐药性的布鲁氏菌。