本发明公开了一种交联琼脂糖亲和介质及其制备方法与应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)将含琼脂糖的分散相与含乳化剂的连续相于微通道反应装置中反应，所得反应液于收集液中固化，得到琼脂糖微球；(2)将步骤(1)所得琼脂糖微球依次经如下步骤处理后得到交联琼脂糖亲和介质；(i)溶胀、活化、多羟基聚合物修饰；(ii)交联；(iii)活化、偶联亚氨基二乙酸配基；(iv)螯合镍离子。经修饰后的微球，用于酶的纯化和固定，解决了酶在复杂的分离纯化的过程中易失活和无法回收再利用等问题，同时合成的亲和介质用于酶的纯化，降低了酶液中杂酶对产物的影响，此方法制备胞苷酸，具有反应条件温和，绿色环保等优势。