本发明公开了一种同时识别杀螟硫磷及甲基对硫磷的纳米抗体制备及应用。该纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述纳米抗体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明所公开的纳米抗体可以应用于杀螟硫磷与甲基对硫磷残留的实际样品检测，该纳米抗体具有较高的热稳定性、较高的有机耐受性及耐弱酸性等特点，可提高杀螟硫磷与甲基对硫磷免疫检测的灵敏度，且操作简单、所耗时间较短。本发明制备纳米抗体的方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质纳米抗体的筛选和制备，具有很高的应用价值。