本发明涉及一种粪肠球菌保存方法及冷冻保存用保存剂，该方法包括以下步骤：(1)菌液制备：将粪肠球菌接种到含有培养基的容器中，静置培养；(2)第一次传代：从培养后的容器中吸取菌液，并与保护剂混匀，进行冷冻，然后解冻，再吸取菌液，接种到另一个含有培养基的容器中，静置培养；(3)第二次传代；(4)第三次传代；(5)分装保存：将培养后的菌液离心，并去掉上清液后，向菌泥加入保存剂，混合均匀，放置一段时间后，低温保存。该保存剂包含以下质量百分比组分：甘油18‑20％，氯化物4‑5％，磷酸氢二盐0.5‑0.56％，磷酸二氢盐0.04‑0.1％，余量水，pH为8.5‑9.0。与现有技术相比，本发明操作简单，菌种稳定性强，能大幅提升冷冻保存后存活率。