本发明涉及一种多层介质光声层析成像方法，包括以下步骤：利用脉冲光对所需成像的多层介质进行照明，利用多个设置外层介质中的换能器从多角度不同位置接收多层介质产生的声信号，并对每个换能器接受的信号做傅里叶变换，形成声压频谱；根据所需成像的分辨率要求，基于多层介质的几何参数，对多层介质进行离散化网格划分；根据频域声传播方程，选取一定数量离散频率点，构建模型矩阵；组合模型矩阵与一定数量离散频率点对应的声压频谱，构建线性方程组；对线性方程组进行求解优化。该成像方法不仅可显著提高多层异质介质内光声层析图像的质量、得到准确的初始声压分布，还可根据实际需要自行设置图像分辨率完成高分辨率高精度成像。