本发明公开了一种玻璃珠填充的硅酮凝胶抗污抑菌涂层的制备方法，包括：(1)将含反应性双键的季铵盐单体、亲水性单体、含巯基硅烷偶联剂与有机溶剂A混合，在惰性气氛下，经引发剂引发制备得到季铵盐亲水聚合物；(2)将步骤(1)制备的季铵盐亲水聚合物、聚硅氧烷、催化剂、玻璃微珠、可选择性加入的交联剂与有机溶剂B共混，经涂覆、固化后得到所述玻璃珠填充的硅酮凝胶抗污抑菌涂层。本发明制备得到的涂层具有优异的抗菌性能、抗蛋白吸附性能和较高的机械强度，适用于海洋防污与生物医疗等领域。