本发明提供了一种适用于电子控制单元的在线标定方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1：通过对多个电子控制单元进行在线程序更新，设置上位机跳过下位机安全访问校验结果，只有一个控制器进入更新程序过程；步骤S2：在在线程序更新过程中进行人为中断，使其停留在引导加载程序中，无法向总线发送数据；步骤S3：在总线上请求刷写程序，直至总线上的电子控制单元仅剩一个有效节点，对总线上仅剩下的一个有效节点标定为其他ID；步骤S4：依次循环步骤S1至步骤S3，直至总线上的电子控制单元的ID均不相同。本发明可在不拆包的情况下，通过在线程序更新重新进行不同ID的标定，避免了更改硬件或线束所带来的复杂操作以及巨大的人力、物力与时间成本。