本发明属于生物技术检测领域，公开了一种抗BVDV‑重要功能蛋白纳米抗体及其制备方法和应用，主要通过构建BVDV‑NS5A表达载体，纯化NS5A蛋白；使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离羊驼外周血淋巴细胞，通过巢式PCR获得VHH基因，构纳米抗体噬菌体展示文库，目的基因插入率为90.8％，文库容量为1.02×107CFU/mL，经M13K07噬菌体救援建立纳米抗体噬菌体展示文库容量为1.68×1016CFU/mL；以BVDV‑重要功能蛋白作为目标抗原，对扩繁得到的噬菌体展示文库进行三轮亲和筛选，从该文库筛选出与E0/E2/NS5A/NS3蛋白特异性结合纳米抗体，通过ELISA检测其反应原性，特异性良好的纳米抗体进行测序，分析序列，进而获得该特异性纳米抗体的基因，构建原核表达载体，对其进行原核表达、纯化和鉴定，得到所需纳米抗体Nb‑Y1、Nb‑Y2、Nb‑Y3，并通过Western blot验证纳米抗体和BVDV重要功能蛋白的反应原性。