本发明公开了一种草莓镶脉病毒载体及其构建方法和在外源蛋白表达中的应用，属于植物基因工程技术领域。草莓镶脉病毒载体为pSVBVSY‑P1‑MCS或pSVBVSY‑P4‑MCS；pSVBVSY‑P1‑MCS的序列如SEQ ID NO.1所示，pSVBVSY‑P4‑MCS的序列如SEQ ID NO.2所示。其构建方法如下：(1)草莓镶脉病毒侵染性克隆的构建：(2)多克隆位点片段的构建：(3)草莓镶脉病毒载体的构建，具体来说，将带有Pml I和BamH I限制性内切酶识别位点的基因序列通过同源重组的方式插入到草莓镶脉病毒侵染性克隆的P1和P2之间或P4和P5制备之间而来。本发明构建的载体通过农杆菌浸润方法真空抽滤接种并稳定高效侵染森林草莓，同时还能在森林草莓上高效表达外源蛋白。