本发明具体涉及一种蚌类环境DNA宏条形码引物、鉴定方法及应用，属于分子生态学领域。本发明公开一种蚌类环境DNA宏条形码引物，所述引物的名称为16SPP300或者16SPP147；其中，引物16SPP300由SEQ ID NO：1所示上游引物和SEQ ID NO：2所示下游引物组成；引物16SPP147由SEQ ID NO：3所示上游引物和SEQ ID NO：4所示下游引物组成。本发明还公开一种用于蚌类群落结构研究的环境DNA宏条形码鉴定方法和应用。本发明方法可补充传统调查方法中难采到、濒危的蚌类动物丰度数据，且能鉴定雄性蚌类物种，有效提高了蚌类的鉴定水平、物种检测率及丰度评估准确度，是有效、可靠的蚌类群落结构调查新方法，具有实用价值。