本发明涉及一种双活性中心罐状聚合物Janus抗菌微球的制备方法，该方法是指首先合成罐状聚合物Janus微球，然后将所述罐状聚合物Janus微球分别采用N,N‑二甲基十六烷‑1‑胺、季铵盐进行两步季铵化，即得双活性中心罐状聚合物Janus抗菌微球。本发明制备方法简单、条件温和、安全洁净、可重复性高，获得的双活性中心罐状聚合物Janus抗菌微球具有高效的抗菌活性和实用性，其将有望应用于生物医学领域和工程领域，尤其是应用于抗菌涂料中。