本发明公开了一种密码子优化的N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶基因及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以苜蓿中华根瘤菌来源的Nodc基因为出发序列，按照解淀粉芽孢杆菌的密码子偏好性将该N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶优化密码子后全基因合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将密码子优化后的N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶构建重组载体，转入宿主解淀粉芽孢杆菌中，得到能够发酵生产几丁寡糖的基因工程菌。该基因工程菌胞外发酵液中几丁寡糖浓度达到676mg/L，其中几丁四糖和几丁五糖的含量分别为246mg/L和430mg/L，表明利用该重组菌株可实现胞外合成几丁四糖、几丁五糖等几丁寡糖为主的新发酵工艺。