本发明提供了一种糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法，包括步骤一；第一单体初步聚合，形成粒径单分散的微球，步骤二；第一单体进一步交联聚合，扩大微球的粒径，步骤三；进一步地引入第二单体和第三单体进行聚合，将两种功能官能团聚合在微球上，步骤四；清洗，将反应体系中的溶剂、分散剂以及多余的单体等除去。本发明克服了现有技术的不足，设计合理，结构紧凑，本发明通过多步分散聚合法，获得含有复合功能官能团的强阳离子交换色谱填料。可以避免现有离子交换色谱填料中单一官能团可能产生的蛋白分离度较差或者部分变异蛋白无法分离以及柱效较低的情况。填料的制备方法简单易于操作，填料的离子交换容量可控。