本发明公开了一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用，属于动物基因工程技术领域，其中所述sgRNA的核苷酸序列如序列表SEQID NO.1‑2所示。本发明通过对sgRNA进行优选，构建相应载体，将其与包含cas9基因的载体一同转入PK‑15细胞中，经筛选得到了可同时稳定表达cas9基因和如SEQ ID NO.1‑2所示的sgRNA的阳性细胞即cas9‑B2PK15细胞株，经测定该细胞株对伪狂犬病毒的基因具有显著敲除能力，因此可显著耐受伪狂犬病毒感染，这对动物生产过程中抗伪狂犬病毒感染具有重要意义；并且基于该细胞株可制备得到抗伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型，在伪狂犬病毒的临床和实验室研究中具有广阔的应用价值。