本发明提供了一种生物传感器及其制备方法，生物传感器包括：电极结构，包括基底、第一导电层、第一绝缘层、第二导电层、第三导电层和第二绝缘层；其中，所述第一导电层形成于所述基底上；所述第一绝缘层形成于所述第一导电层上，并使所述第一导电层的一部分区域裸露以形成工作电极；所述第二导电层形成于所述第一绝缘层上；所述第三导电层形成于所述第二导电层的部分区域上；所述第二绝缘层至少形成于所述第二导电层上，并使所述第二导电层的一部分区域裸露以形成对电极，且使所述第三导电层的至少一部分区域裸露以形成参比电极；以及，反应膜层，形成于所述工作电极上，用于与目标物发生电化学反应。该生物传感器结构简单合理，有利于批量生产。