本发明涉及一种基于质谱的复杂交联肽段鉴定方法，属于生物分析技术领域。本发明所述方法首先对蛋白质库中的蛋白质进行理论酶切并建立肽段索引；然后对每条肽段上的交联位点进行假设并建立离子索引；之后对谱图进行离子互补假设并使用离子索引进行肽谱匹配，最后经粗打分、细打分和重打分后获得最终结果。所述方法可直接实现谱图与所有满足条件的交联肽段进行肽谱匹配，并且谱图的正确结果肽段基本分布在排名靠前位置，只需要在一个很小的检索空间内再进行一次细打分将正确结果召回。