本发明属于植物超微结构检测技术领域，特别涉及一种研究植物细胞壁中半纤维素微观分布的方法。本发明首先对植物组织切片进行脱蜡质、脱灰分、脱木素，随后，对其进行氢氧化钡选择性分级抽提分离半纤维素；然后对不同抽提阶段的植物组织切片进行洗涤、封闭和第一抗体孵育处理；第一抗体孵育后对植物组织切片进行洗涤并进行第二抗体孵育；最后用激光共聚焦显微镜观察植物组织切片。本发明将氢氧化钡选择性分级抽提半纤维素和可特异性结合不同种类半纤维素的第一抗体结合起来，有效准确地识别观察不同种类半纤维素在植物细胞壁中的分布。