本发明涉及乳品加工技术领域，公开了一种乳清蛋白源缓解体力疲劳功能肽及其制备方法。本发明在制备缓解体力疲劳功能肽的过程中，依次采用蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3对乳清蛋白进行分步酶解。所述蛋白酶1、蛋白酶2和蛋白酶3均用于水解羧基侧和/或氨基侧具有芳香族或疏水性氨基酸的肽键；优选地，所述蛋白酶1为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌来源的蛋白酶，所述蛋白酶2为解淀粉芽孢杆菌来源的蛋白酶，所述蛋白酶3为米曲霉来源的蛋白酶。本发明采用特定的三种蛋白酶进行分步酶解，能够将乳清蛋白的水解程度控制在适宜范围内，获得效果较好的缓解体力疲劳功能肽。