本发明提供一种细胞转染装置、细胞转染方法及微流道制作方法，装置包括微流控芯片及可调谐挤压机构，微流控芯片内设有微流道，微流道内设有一受限空间，多个外源物质设于微流道内；可调谐挤压机构包括微针尖、压电致动器及悬臂梁；当压电致动器振动时，带动微针尖上下运动、挤压或脱离微流控芯片，带动受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，外源物质通过通孔进入到细胞内。上述细胞转染装置、细胞转染方法及微流道制作方法，通过可调谐挤压机构规律性的挤压或脱离微流控芯片，使得微流道的宽度可变，从而适用于不同大小的细胞，解决了传统固定宽度的微流道只适用于特定大小或者变形力的细胞，对大分子的纳米外源物质的转染效率低下的问题。