本发明涉及一种巯基化合物功能化氧化石墨烯薄膜的制备及其在手性分离中的应用，包括步骤如下：在室温条件下，将氧化石墨烯纳米薄片在有机溶液中超声分散；随后，加入偶氮二异丁腈和巯基手性化合物，在惰性环境中，于50‑200℃反应；反应完成后，洗涤、纯化、成膜，即得巯基化合物功能化氧化石墨烯薄膜。本发明通过硫醇‑烯点击反应将含有巯基的手性化合物，如半胱氨酸、含半胱氨酸的蛋白以及含有巯基的手性高分子化合物等，直接加入到石墨烯网络的C＝C键中，可以提高手性选择器参与分离的过程，增加手性分离膜的膜通量和选择性。