本发明公开一种粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的制备工艺，包括如下步骤：S1、取活化复壮后的粪产碱杆菌接种至盛装种子培养液的培养基中，培养得到种子液；S2、取种子液加入发酵培养液中，发酵得到发酵液；S3、将发酵液先在离心得到湿重菌体，再取湿重菌体悬浮于磷酸缓冲液中，再加入乙酸丁酯得到粗提取溶液，再将粗提取溶液分离提取得到初步酶液；S4、将初步酶液经冰浴、冰浴、超声破碎、离心得到粗酶液；S5、采用阴离子交换层析法，将S4中得到的粗酶液进一步提纯，得到纯酶。本发明通过在发酵液中添加微量元素溶液与基础盐溶液可提高AfPGA产率，同时在发酵液中添加苯乙酰苯基丁氨酸溶液与NIPAB溶液，刺激粪产碱杆菌合成AfPGA，提高AfPGA的活力与酶量。