本发明提供了一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像系统及方法，包括：第一激光器、荧光信号产生单元、分束单元、第一信号通道单元、第二信号通道单元、探测器以及控制终端；其中，第一信号通道单元包括第一柱透镜，第二信号通道单元包括第二柱透镜，第一柱透镜和第二柱透镜的取向相互正交；分束单元用于将荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；第一信号通道单元和第二信号通道单元用于分别将两束荧光信号投射至探测器进行成像；控制终端用于根据正反向像散点扩散函数图像对进行三维定位以及超分辨成像。本发明的系统在无需牺牲原有成像深度的前提下提高离焦荧光分子的三维定位精度，三维定位准确率高，有效探测范围大。