本发明涉及一种水生生物光暴露行为采集装置及其使用方法，该采集装置包括：行为采集模块和灯光控制器；其中，所述行为采集模块包括：暗箱；光板，设置于所述暗箱内部的上表面，用于提供不同的光谱、光照强度和光照周期；摄像头，设置于所述暗箱内部的侧壁上，用于摄录采集不同光谱、光照强度和光照周期暴露下的水生生物运动行为；所述灯光控制器与所述光板连接，用于对所述光板进行光谱、光照强度和光照周期的调节。通过本发明不仅可以实现全波段光谱，能够对光照强度和光周期精准调控，为光暴露试验提供精确的环境条件；而且可以实现水生生物行为实时跟踪；还可以进行多组试验同时摄录，节约试验成本，缩短试验时间。