本发明公开了布比卡因氮氧化物杂质的分离纯化及单晶制备方法，所述方法将布比卡因原料药溶于过氧化氢获得溶液；再采用制备液相或半制备液相与质谱联用收集制备杂质组分；然后将杂质组分减压浓缩至干，得到布比卡因的杂质。将该杂质溶于易溶溶剂后加入难溶溶剂，静置，溶剂自然挥发，得到所述布比卡因的杂质的单晶。本发明公开的布比卡因氮氧化物杂质的分离纯化方法及单晶制备方法，为布比卡因氮氧化物杂质的结构表征提供依据，能够为布比卡因原料药的质量研究提供杂质标准品。