本发明提供了一种自支撑纳米纤维阴离子交换层析膜及其制备方法。该自支撑纳米纤维阴离子交换层析膜为由经过同步或不同步交联和改性双处理的纳米纤维相互堆叠复合而成的膜材料；所述自支撑纳米纤维阴离子交换层析膜的膜厚度为20～200μm，平均孔径为500～800nm。该自支撑纳米纤维阴离子交换层析膜表面含有正电性官能团，用以在预定pH值下，吸附溶液中呈负电的生物大分子。该制备方法基于PVA‑co‑PE纳米纤维分散液基体，通过多元醛类和含胺基、季胺类化合物的原位交联，制备表面胺化的PVA‑co‑PE纳米纤维膜，对生物大分子的饱和容量较高，还具备高缓冲溶液通量和高动态吸附性能，这为离子交换层析膜的制备和大规模应用提供了一种新的策略。