本发明涉及甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法及应用；通过在野生型的甘氨酸核糖开关元件序列上进行突变，从文库高通量筛选出性能提升，甘氨酸响应范围增加和振幅值增加的甘氨酸‑ON的突变体和构象改变的甘氨酸核糖开关突变体，从而可以实现基因的表达调控。本发明同时将野生型甘氨酸‑ON转变为甘氨酸‑OFF核糖开关,同时也增加了核糖开关的振幅值。本发明还提供了筛选性能提升与构象改变的甘氨酸突变体方法以及含有这些突变体的表达载体和宿主细胞。本发明的甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建及性能提升与构象改变的突变体是目前在大肠杆菌内首次报道基于甘氨酸核糖开关线路和性能提升的有效突变体。