本发明公开了一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及应用，属于基因检测技术领域，本发明将双标记自淬灭的TaqMan探针熔解曲线技术与两条邻近单标记探针联合淬灭的熔解曲线技术相结合，提出一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及应用。本方法利用双标记自淬灭的TaqMan探针熔解曲线技术，获得正常的熔解峰，利用两条邻近单标记探针联合淬灭的熔解曲线技术获得倒置的熔解峰，实现单色荧光通道中，一个靶标的检测结果呈现正的熔解峰，另一个靶标的检测结果呈现负的熔解峰，使得单色荧光通道可同时检测至少两种靶标，本发明利用现有荧光PCR平台有限的荧光检测通道和在较窄的温度范围内单管实现多重靶标的检测，具有较大的市场和应用前景。