本发明公开了一种用于检测18种病原体的多重PCR引物和探针组合及其应用。本发明以甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人副流感病毒（区分I型，II型，III型）、肠道病毒、登革病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒为目标，研发设计得到了可用于同时检测上述18种病原体的多重PCR引物和探针组合，并在此基础上开发了相应的基因芯片和检测试剂盒。本发明设计获得的引物和探针方案的特异性强、检测范围广、结果准确性好，不仅有助于传染性病原体的防控，还可用于相应病原体的室间质评等。