本发明属于高分子材料制备技术领域，具体公开了一种羧基化聚苯乙烯纳米微球及其制备方法与应用。本发明将苯乙烯、羧基单体和引发剂混合溶液分散到含有稳定剂的乙醇水溶液，在60～80℃下反应6～12h，得到羧基化聚苯乙烯纳米微球。通过乙醇和水多次离心洗涤，除去未反应的单体及其他小分子物质得到粒径大小均一的羧基化聚苯乙烯纳米微球溶液。本发明制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球表面携带有羧基，具有表面反应能力好、比表面积大等优异的性质，对生物分子(如蛋白质)具有很高的反应活性，可应用于细胞标记、蛋白标记等生物医学领域。