本发明涉及一种提高D‑生物素产量的生产方法，属于生物技术领域。本发明公开了一种提高D‑生物素产量的生产方法，该方法是采用易变假单胞菌(Pseudomonas mutabilis)基因工程菌，以葡萄糖和甘油为复合碳源，并采用两阶段或三阶段控温策略，结合乙醇补料工艺进行D‑生物素的快速发酵生产，较原始工艺产量提高了21％‑170％，周期缩短了13％‑28％。本发明提供了一种简便、安全、高效的D‑生物素发酵生产方法，改变了已有生产工艺步骤，显著提高了D‑生物素的生产强度，不仅缩短了发酵周期，节约了成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，另外，工艺简单易放大，易于实现工业化生产。